免疫分析法在兽药残留分析中的应用

免疫分析法在兽药残留分析中的应用

    摘　要:免疫分析是利用抗原与抗体的特异性结合反应为基础的分析技术,以抗体为核心试剂,具有高选择性、高灵敏度等特点。免疫分析在兽药残留分析中有广泛的应用前景,已经渗透到兽药残留分析的各个环节。

    文章主要从分析原理出发,对免疫亲和色谱( IAC) 、酶免疫分析( EIA) 、发光免疫分析(L IA) 、荧光免疫分析( FIA) 和生物传感器(biosensor) 的应用进行了综述,并展望了其前景。

    关键词:免疫分析;兽药残留

    近年来,动物性食品的安全性已经成为社会共同关注的公共卫生问题,而兽药残留作为动物源性食品安全性的重要影响因素,已成为人们普遍关注的一个社会热点问题。兽药残留不仅直接对人体产生急慢性毒性作用,引起细菌耐药性的增加,还通过环境和食物链的作用对人体健康造成潜在危害。加强兽药管理和兽药残留分析是控制兽药残留的重要手段。兽药残留的分析方法一般有免疫分析法、气相色谱法、高效液相色谱法和毛细管电泳法等。其中,免疫分析法具有高度的选择性和灵敏度、分析过程简化等优点,有很大的发展前景,本文着重探讨免疫分析法的应用及进展。

    免疫分析(immunoanalysis) 是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合为基础的新型分析技术。抗原与抗体的初级结合反应遵守质量作用定律,可用著名的Scatchard 方程来描述。1959 年,美国科学家Yalow 和Berson 利用125 I 标记的胰岛素与血浆中的胰岛素竞争有限的抗体,以此为基础建立了胰岛素的放射性免疫测定法,从而开创了免疫分析这一崭新领域,被公认为痕量分析化学方面的重大突破。

    此后又发展了许多替代(alternative) 或非同位素免疫分析法。20 世纪90 年代初, 美国化学学会(ACS) 陆续出版了食品和环境中化学污染物免疫分析方面的若干论文集,标志着免疫分析技术作为一种分析手段正日趋成熟并被分析化学界接受。免疫学技术作为一种分析手段,已经渗透到兽药残留分析的各个环节,包括样品提取、净化、分离和检测。其高度的选择性和灵敏度使分析过程简化,有的甚至已经不需要前处理过程。目前应用的兽药残留免疫分析技术可分为两个基本类型: ①免疫净化法,如免疫亲和色谱法( IAC) ; ②免疫测定法( IAs) ,如酶免疫分析( EIA) 、发光免疫分析(L IA) 、荧光免疫分析(FIA) 、生物传感器( bio sensor) 等,一般都作为相对独立的分析方法。还有在此基础上的联用技术,如IAC/ HPLC、HPLC/ IAC 等。

    1、免疫净化法

    免疫亲和色谱( immunoaffinity chromatograp hy , IAC) 作为免疫净化法是以抗原抗体的特异性、可逆性免疫结合反应为原理的色谱技术,其基本过程为将抗体与惰性基质(如珠状琼脂糖、键合相硅胶) 偶联制成固定相,装IAC 柱。当含待测组分的样品通过IAC 柱时,固定抗体选择性地结合待测物,其他不被识别的样本杂质则不受阻碍地流出IAC 柱,经洗涤除去杂质后将抗原-抗体复合物解离,待测物被洗脱,样品得到净化。IAC 通常只需“加样-洗涤-洗脱”一步层析就可使复杂样本中痕量的特定组分得到高度纯化和浓缩,具有特异性强、结合容量大、洗脱条件温和、色谱柱可以方便地再生并重复使用等特点,所以非常适用于复杂样本中痕量兽药残留的分离和分析。IAC 对待测组分有很强的保留和浓缩能力,免疫后期抗体的亲和常数可达1010 mol/ L～1012 mol/ L ,免疫吸附剂的等温吸附曲线曲率很高,只要加样量不超过IAC 的柱容量,在实测样本条件下IAC 对组分的保留能力几乎不受样本体积或组分浓度的影响。

    20 世纪60 年代末,溴化氰活化琼脂糖载体的出现奠定了IAC 的发展基础,1987 年Van de Water等首次使用IAC 净化了肌肉中的氯霉素。Crabbe P等[1 ] 报道,使用IAC 净化动物体内的磺胺二甲基嘧啶有很高的回收率(92 %～100 %) 。近年来,李俊锁等对IAC 及其在兽药残留分析中的应用进行了探索,以IAC 为基础已建立了若干测定阿维菌素和伊维菌素残留的方法。Shen J 等[2 ] 试验报道用IAC净化肉鸡组织中残留的马杜霉素,回收率为76. 4 %～107. 5 % ,并以此为基础进行酶联免疫吸附试验,检测限分别为肌肉组织1. 0 ng/ g ,肝脏2. 8 ng/ g ,脂肪1. 5 ng/ g ,表明这种方法的可行性很高。HorneE 等[3 ] 也报道采用IAC 净化兔肝脏中的噻苯咪唑( TBZ) ,以此为基础进行高效液相色谱,使得TBZ的检测更加便利。由此可见, IAC 是兽药残留分析中最有效的净化方法之一[4 ] 。随着单克隆抗体技术的发展, IAC 在残留分析中定会有更广阔的前景。

    2、免疫测定法

    2. 1 　酶免疫分析法

    酶免疫分析分为均相酶免疫测定法( homogenous EIA) 和非均相酶免疫测定法( heterogenous EIA) 。1966 年Avrameas 和Uriel 首先将酶偶联于抗原或抗体,1971 年Engvall 和Perlman 创立了酶联免疫吸附试验(enzyme2linked immunosorbent as say , EL ISA) ,属于非均相酶免疫测定技术,是EIA的典型代表,也是兽药残留检测的常用方法之一。

    一般将抗原或抗体吸附于固相载体进行免疫酶反应,底物显色后用肉眼或分光光度法进行检测。

    1974 年Syvaco 又报道了酶放大免疫测定法( enzyme multiplied immunoassay technique , EMIT) ,属于均相酶免疫分析,开创了酶免疫分析的临床应用。此法的基本原理是在抗体或抗原分子上连接酶分子,进行免疫反应,免疫复合物上的酶将特定的底物转化为特定的颜色,用酶标仪测定,由颜色的深浅确定待测物的量。

    目前,兽药残留的EL ISA 检测方法已经相当成熟[5 ] ,其中磺胺类、氯霉素类、苯并咪唑类、同化激素类、苯乙胺(β-受体激动剂) 类药物一般采用抗体包被直接竞争法,氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类药物一般采用抗原包被直接竞争法,β-内酰胺类、喹诺酮类、阿维菌素类、聚醚类和多肽类药物一般采用抗原包被间接竞争法。近两年来,Cooper J 等[6 ] 将EL ISA 应用于吩噻嗪、乙酰丙嗪、氯丙嗪等镇静药的残留检出,兔子肾脏组织中的检测限分别为5 ,5μg/ kg 和20μg/ kg ,结果表明这仍然是一种快速的而且灵敏度高的多残留检测方法。Cooper K M等[7 ] 采用EL ISA 测定对虾中的呋喃唑酮代谢物,检测限为0. 1μg/ kg灵敏度较液相色谱法和液质联用法都有很大的提高。在国内,秦燕等[8 ] 采用水解衍生2酶联免疫分析这一新方法,测定了动物肌肉中的呋喃唑酮代谢物,方法是将样品中的呋喃唑酮代谢物3-氨基-唑烷酮(3-amino-2-oxazolidone ,AOZ) 的蛋白结合残留物经酸水解释放AOZ ,经2-硝基苯甲醛(2-nit robenzaldehyde ,NBA) 衍生生成3 ( ( (2-ni-t rop henyl ) methylene )-amino )-oxazolidinone(NPAOZ) 后,调p H 至7. 2～7. 4 ,经乙酸乙酯萃取后,以4 000 r/ min离心100 min ,取上层氮气流于30℃吹干,并入缓冲液溶解,正己烷脱脂后取下层水相进行NPAOZ 的EL ISA , 结果显示定量检测限为200 ng/ kg ,回收率在85 %以上,此方法可实现其代谢残留的高通量筛选。

    2. 2 　发光免疫分析

    20 世纪80 年代末,国外开始用化学发光试剂来标记抗原或抗体,从而建立了发光免疫分析技术。

    狭义的发光免疫分析(luminescence immunoassay ,L IA) 主要是指化学发光免疫分析(chemilumines-cence immunoassay , CL IA) 。另外,还有酶放大化学发光免疫分析和电化学发光免疫分析( elect ro-chemiluminescence immunoassay , ECL IA) 。

    (1) 化学发光免疫分析。化学发光免疫是将标记物改为能产生化学发光的化合物,最后的信号是化学发光的强弱,以代替放射性测定。常用的发光剂为氨基苯二酰肼(异鲁米诺和鲁米诺) 和吖啶酯类。抗体通常标以小分子吖啶酯(acridinium ester ,AE) ,AE 的分子质量小(48 ku) ,有空间阻碍小、增加标记物的扩散、1 s 内完成快速强发光、非靶物质不产生化学发光和37 ℃温育非平衡期反应等特点,明显缩短检测时间以达到快速诊断的目的。

    Lin S 等[9 ] 将CL IA 应用于脱脂乳中氯霉素(CAP) 残留的测定,使用辣根过氧化物酶标记抗原,结果显示这种方法与传统的酶免疫分析有相似的灵敏度(0. 05 ng/ mL) 和精确度,批内变异系数< 8 %,批间变异系数< 20 % ,回收率为87 %～100 % ,检测限为0. 1 ng/ mL～10 ng/ mL ,均显示了良好的线性关系。(2) 电化学发光免疫分析。电化学发光的原理是,由发光剂三联吡啶钌[ Ru ( bpy) 32 + ] 和三丙胺( TPA) 在阳电极表面同时失去电子发生氧化反应,即将2 价的Ru (bpy) 32 + 氧化为3 价的Ru (bpy) 33 + ,而TPA 成为阳离子自由基( TPA + ·) 。后者自发失去了一个质子( H+ ) 形成自由基( TPA ·) ,此TPA ·作为强的还原剂,将3 价的Ru (bpy) 33 + 还原成2 价的激发态的Ru ( bpy) 32 + ,后者衰减时发出波长为620 nm 的光子,回到基态,在阳极上重新形成Ru(bpy) 33 + ,这一过程在电极表面周而复始地进行,光信号明显增强。ECL IA 是将电化学发光和免疫检验这两种分析法与亲和素、同相磁微粒相结合而融为一体的新的标记免疫分析技术。

    Liang P 等[10 ] 在1996 年就报道采用ECL IA 来对牛奶中β2内酰胺类抗生素以及β2内酰胺酶进行了成功的检测。Pang Y Q 等[ 11 ] 也采用CL IA 来进行蜂产品中四环素类抗生素残留的测定,方法是将三联吡啶钌(Ru ( bpy) 32 + ) 和三丙胺( TPA) 维持在电压1. 05 V 、p H8. 0 的碳酸盐缓冲液,用来检测四环素和土霉素, 检测限分别为4. 0 ng/ mL 和3. 8 ng/ mL ,结果表明,这种方法的灵敏度高于所报道的绝大多数方法。

    2. 3 　荧光免疫分析法(fluoroimmunoassay ,FIA)

    早在20 世纪40 年代就有用荧光素来标记抗原或抗体, (fluoroimmunoassay , FIA) 的方法有很多,如底物标记荧光免疫分析法、荧光偏振免疫分析法(fluorescene polarized immunoassay , FPIA) , 以及现有免疫方法中灵敏度最高的时间分辨免疫分析法(timed2resolved fluoroimmunoassay , TRFIA) 等。

    TRFIA 是20 世纪80 年代初Pet ter sson 等和Eskola 等创立的一种非放射性标记免疫技术,与传统的荧光素标记不同,它是以镧系元素,如铕( Eu) 、铽( Tb) 、钐(Sm) 和铌(Nd) 等标记抗体,因此又称为“解离-增强镧系荧光免疫分析法”( dissociation-enhancement lant hanide fluroimmunoassay ,DEL FIA) ,利用时间分辨荧光仪特定的延迟一段时间测量,获得Eu + 的特异荧光信号,几乎能够完全消除各种非特异性荧光物质的干扰,并且实现了分析方法灵敏度的突破, 灵敏度可高达10 - 19 mol/ L 。

    Stead D A[12 ] 在2000 年就报道可以采用TRFIA 来分析动物性产品中氨基糖苷类抗生素的残留。另外Crooks S R 等[13 ] 也报道采用TRFIA 来检测牛奶中的双氢除虫菌素,检测限为4. 6 ng/ mL ,批内变异系数为11. 6 % ,批间变异系数为15. 8 %。表明这种方法有更加广泛的应用前景。

    2. 4 　生物传感器

    传感器通常由直接响应于被测量的敏感元件、产生可用信号输出的转换元件和相应的电子线路所组成,一般可分为物理传感器、化学传感器和生物传感器(biosensor) 。生物传感器是以生物学组件作为主要功能元件,能够感受规定的被测量物并按照一定规律将其转换成可识别信号的器件或装置。它一般由生物识别元件、转换元件、机械元件及电气元件组成。国外目前研制成功的传感器已有许多,如青

霉素传感器、谷胺酰胺传感器、谷氨酸传感器[14 ] 。

    目前,生物传感器已经成功的检测了食品中的农药残留、生物毒素、食品添加剂等。裴艳涛等[15 ]报道,采用生物传感器技术检测动物性食品中“盐酸克伦特罗(瘦肉精) ”残留量有明显的优越性。Caldow M 等[16 ] 报道,直到目前为止所使用的色谱分析法检测蜂蜜中的泰乐菌素的检测限都大于10μg/ kg ,但是他们采用生物传感器技术检测蜂蜜中的泰乐菌素其检测限可达到2. 5 μg/ kg。在进行牛奶中抗生素残留的检测时, Gustavsson E 等[]报道采用表面等离子体谐振(SPR) 传感器来检测其中的β2内酰胺类抗生素,检测限为1. 5μg/ kg ,变异系数< 5 % ,表明这是一种灵敏度极高的检测方法。

    Knecht B G等[19 ] 也报道采用PASA 生物传感器技术进行牛奶中抗生素的多残留检测,如青霉素、磺胺嘧啶、链霉素、庆大霉素等。所有的样品处理都是全自动的,每个样品的检测均不超过5 min ,而且检测限为0. 12 μg/ L ～ 32 μg/ L 。另外, Ferguson J P等[20 ] 报道,检测牛肌肉中的链霉素时,采用免疫-生物传感器,检测限为70μg/ kg。

    3、免疫分析法的发展前景

    目前,几乎所有重要的兽药残留已建立或试图建立免疫测定法(多数是EL ISA) ,如青霉素、链霉素、四环素、氯霉素、磺胺二甲基嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶、莫能菌素、沙拉沙星、盐霉素、阿维菌素等。另外,还有一些联用技术,如IAC-HPLC、IAC-GC 等,如用于氯霉素、已烯雌酚、甲基睾酮/ 去甲睾酮、阿维菌素、依维菌素等残留的分析,有的已开发了商品化的试剂盒[14 ] 。未来兽药残留分析技术中的免疫分__析技术将向试剂标准化、使用更灵敏和抗干扰性强的标记物以及与理化分析技术联用方向发展。目前,国内所采用的兽药残留免疫分析方法基本上都是EL ISA ,国外陆续报道了化学发光免疫技术、电化学发光免疫技术、荧光免疫分析及生物传感器等先进技术,这些方法都有更加广泛的应用前景,一旦方法成熟,它们的高灵敏度、高特异性将使兽药残留的分析方法产生质的飞跃。因此,我们正在进行这一方面的研究,期望进一步发展拓宽免疫分析技术。